Prof. i. R. Dr. rer. nat. Bärbel Friedrich

• SFB 498 I-III: Schlüsselreaktionen der biologischen Wasserstoffaktivierung am Beispiel der [NiFe]-Hydrogenasen (Teilprojekt C 10)

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  Die biologische Spaltung von H2 ist ein in Prokaryoten und niederen Eukaryoten weit verbreiteter Stoffwechselprozess, der durch zwei Klassen von Metalloenzymen, die [NiFe]- und die [Fe]-Hydrogenasen, katalysiert wird. Im Mittelpunkt dieses Projektes stehen die drei funktionell unterschiedlichen [NiFe]-Hydrogenasen aus Ralstonia eutropha (früher Alcaligenes eutrophus). Es handelt sich dabei um die regulatorische Hydrogenase (RH), die NAD-reduzierende, lösliche Hydrogenase (SH) sowie die membrangebundene Hydrogenase (MBH). Das Arbeitsprogramm umfasst die drei folgenden Aspekte:<br>-Im Vordergrund der molekulare Analyse der initialen Schritte der H2-Sensierung steht die Identifizierung des neuartigen Redox-Kofaktors. Desweiteren soll dessen Interaktion mit verschiedenen funktionellen Domänen der RH untersucht werden. Ausgewählte RH-Mutantenproteine, die Veränderungen im Gastransport zum aktiven Zentrum bzw. im Elektronen- und Protonentransfer aufweisen, werden eingehend mit einer Vielzahl von biochemischen und spektroskopischen Methoden charakterisiert. Unter Einbeziehung neuer Reinigungsstrategien sollen die Versuche zur Gewinnung von RH-Kristallen für die Röntgen-Strukturanalyse weitergeführt werden.<br>-Die Studien an den beiden Energie-wandelnden Hydrogenasen (SH und MBH) werden sich auf die weitergehende Charakterisierung des [NiFe]-Zentrums konzentrieren, welches im Fall der SH zwei zusätzliche diatomare CN--Liganden enthält. Es soll untersucht werden, inwieweit dieses veränderte Zentrum für die besonderen spektroskopischen und katalytischen Eigenschaften der SH, vor allem für die ausgeprägte O2-Toleranz des Enzyms, verantwortlich ist.<br>-Die Assemblierung des in seiner Struktur einzigartigen [NiFe]-Zentrum erfordert eine Kaskade von Reifungsschritten, die durch die sogenannten Hyp-Proteine katalysiert wird. Um den Prozess der Einbettung des Kofaktors in die Proteinmatrix besser zu verstehen, haben wir ein neues Projekt in unserer Arbeitsprogramm aufgenommen. Die Experimente werden sich auf zwei Fragestellungen konzentrieren: (i) Ist das HypX-Protein für die Insertion der zusätzlichen diatomaren Liganden verantwortlich und dient ein Derivat von Tetrahydrofolat als C1-Gruppen-Donator? (ii) Ist eine verkürzte Version des HypF-Proteins, der zwei konservierte Domänen fehlen, ausreichend für die Insertion der diatomaren Liganden in das katalytische Zentrum? Für die Beantwortung dieser Frage, werden sowohl das verkürzte HypF1-Protein, das in der MBH-Genregion kodiert wird, als auch das prototypische HypF2-Protein aus der SH-Genregion einer Kombination aus in vivo- und in vitro-Experimenten unterworfen.

• Stickoxid-Metabolismus in Ralstonia eutropha H16 (ehemals Alcaligenes eutrophus) III

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  Die Sensierung und Entgiftung von NO wird als potentieller Schutzmechanismus pathogener Mikroorganismen gegen die menschliche Immunantwort diskutiert. Unter Einbeziehung bislang bekannter bakterieller Genome ist die in R. eutropha erstmals charakterisierte chinolabhängige NO-Reduktase (qNor) unter pathogenen Bakterien weit verbreitet. In R. eutropha wird die Expression von qNor durch einen neuartigen, vermutlich NO direkt sensierenden Transkriptionsaktivator NorR gesteuert. Dies ist ein für experimentelle Untersuchungen gut zugängliches System und bietet sich als Modell zur Aufklärung der NO-Sensierung an. Über den Mechanismus der NO-Sensierung in Bakterien ist bislang wenig bekannt. Im Rahmen dieses Vorhabens soll sowohl die NO-abhängige Signalrezeption als auch die DNA-Bindung von NorR näher untersucht werden. Dabei soll geprüft werden, ob die NO-Bindung von einem Kofaktor abhängt. Erste Hinweise, dass das mit dem qNor Gen norB kotranskribierte norA Genprodukt die Transkriptionsaktivierung moduliert, werden experimentell weiter verfolgt. Ein besonderes Strukturmerkmal der qNor Enzyme ist eine N-terminale Extension mit bislang unbekannter Funktion. Die weitere molekulare und biochemische Charakterisierung von NorB wird insbesondere diese Extension berücksichtigen. Durch ortsgerichtete Mutagenese und die Expression funktioneller Module sollen dabei auch Fragen zur Bindung des Elektronendonors, zum Elektronentransport und zur Interaktion mit weiteren Proteinen beantwortet werden.

• Globale Katabolit-Kontrolle eines Sigma 54-abhängigen Hydrogenase-Regulons II

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  Im Mittelpunkt des Forschungsvorhabens steht die Regulation eines prokaryotischen Metalloenzym- Systems, das die Verwertung von molekularem Wasserstoff als alternative biologische Energiequelle erschließt. Der Modellorganismus Ralstonia eutropha (ehemals Alcaligenes eutrophus) besitzt hierfür zwei [NiFe] Hydrogenasen, deren Synthese eine Vielzahl posttranslationaler Schritte umfaßt. Die dafür erforderlichen Gene sind Teil eines komplexen Regulons, dessen Expression von zwei essentiellen Transkriptionsfaktoren gesteuert wird, dem alternativen Sigmafaktor 54 der RNA-Polymerase und dem zur NtrC-Familie gehörenden Response-Regulator HoxA. Die Aktivität von HoxA wird durch einen von Standardsystemen abweichenden dualen Mechanismus reguliert. Eine spezifische Signaltransduktionskette, bestehend aus dem H2-Rezeptor HoxBC und der Histidin-Protein-Kinase HoxJ, moduliert die Aktivität von HoxA in Abhängigkeit von Wasserstoff über Phosphorylierung/ Dephosphorylierung. Anders als in konventionellen Zweikomponenten-Systemen aktiviert offensichtlich die nicht-phosphorylierte Form von HoxA die Transkription. Darüber hinaus wird die Aktivität des Regulators in Abhängigkeit vom allgemeinen Energiestatus der Zellen (Katabolit-Kontrolle) dominant kontrolliert. Das Arbeitsprogramm zielt darauf ab, den molekularen Mechanismus dieser globalen Regulation aufzuklären. Anknüpfend an die bereits vorliegenden HoxA-Funktionanalysen sollen weitere Mutationen in den drei konservierten Domänen von HoxA Aufschluß über alternative Phosphorylierungsstellen und/oder andersartige Modifikations-mechanismen geben. Von Untersuchungen der zentralen und C-terminalen Domäne erwarten wir Erkenntnisse über die ATPase-Aktivität sowie die Dimerisierung und die Oligomerisierung von HoxA. Bezüglich der Katabolit-gesteuerten Modulation von HoxA werden drei Möglichkeiten diskutiert: (i) Die direkte Interaktion mit intrazellulären niedermolekularen Substanzen, die den Energiestatus signalisieren, z.B. NAD(P)H oder phosphorylierte Verbindungen; (ii) die Beteiligung eines weiteren regulatorischen Proteins, das die Aktivität von HoxA und/oder die des Sigmafaktors moduliert; (iii) die Mitwirkung eines zweiten DNA-Bindeproteins, das in konzertierter Aktion mit HoxA die Transkription positiv oder negativ beeinflußt.

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